ELISA实验步骤：

1、试剂准备：根据选择的试剂盒准备好相关试剂。

2、样品准备：血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织标本等。

3、试剂的配置

4、抗体包被：Coating Buffer: 稀释成Coating Buffer （1×），根据产品说明书稀释抗体，每孔加入100ul预稀释的抗体，4°C过夜孵育（16-18h）。

5、使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。 

6、根据实验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目。样品（含标准品）和空白都应做复孔。 

7、加样：100  μL/well 加入稀释后的 Cytokine   standard 至标准品孔，100  μL/well 加入样

品至样品孔，100  μL/well 加 Dilution buffer R (1×)入空白对照孔。 

8、加检测抗体：根据产品说明书加入 Biotinylated antibody 。 混匀后盖上封板膜，室温孵育。 

9、洗板：扣去孔内液体，300 μL/well 加入 1×washing buffer；停留 1 分钟后弃去孔内液体。重复 3 次，每一次在滤纸上扣干。 

10、加酶：根据产品说明书加入稀释好的酶，孵育。 

11、洗板：重复步骤 5 。 

12、显色：100 μL/well 加入 TMB，室温（18-25℃）避光孵育5-30分钟之间，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。 通常显色 10-20 分钟可以达到很好的效果。 

13、终止反应：迅速 100 μL/well 加入 Stop solution  终止反应。

14、读板：终止后 10 分钟内，用检测波长（measurement wavelength）450 nm 读值。推荐用双波长即检测波长（measurement wavelength）450 nm 、参考波长或校正波长（reference wavelength ）610-630 nm 同时读板，测量结果会更准确。

 

ELISPOT实验步骤：

第一天：ELISPOT包被程序，提供两种方案供选择（严格注意无菌操作）

方案A: 传统酒精预湿包被程序 
该方案中，需经过：70％乙醇预湿PVDF膜、无菌去离子水洗涤去除乙醇、拍干，最后，加入已稀释好的包被抗体到各实验孔完成包被操作。 
具体操作如下： 
1. 实验卡片填写：设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。 
2. 每孔加入15μL 70%的乙醇预湿。

注意： 
未润湿PVDF膜是洁白、不透明的；经乙醇润湿后，颜色变暗，呈半透明状，很容易观察二者的区别。 
加乙醇时，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不要刺到PVDF膜。 
若加入的乙醇挂在孔壁上，盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。 
15μL是经过优化的体积，能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。请勿随意加大用量！ 
膜在润湿后如果不做处理，大约10min后由于乙醇的挥发会重新变干。所以应该在膜变干之前加入去离子水，两步的时间间隔不要超过5min。否则，膜需要重新润湿。 
3. 洗涤：100μL/孔加入去离子水，洗涤2次。 
本次洗涤目的在于：除去预湿用的乙醇。因此应该尽量洗涤干净，减少残留。 
4. 包被：按说明书操作。50μL/孔加入用1×PBS稀释好的包被抗体，4°C包被过夜。 
5. 封闭：（次日）倾倒包被液，用无菌1×PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入稀释好的封闭液，37°C封闭1h。 
6. 倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。

方案B: Magi™ Coating Buffer润湿包被程序 
该方案中，用Magi™ Coating Buffer润湿PVDF孔后，直接加入用1×PBS稀释的包被抗体，即可完成抗体的包被。 
1. 实验卡片填写：设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。 
2. 每孔加入15μLMagi™ Coating Buffer预湿。

注意： 
未润湿PVDF膜是洁白、不透明的，经Magi™ Coating Buffer润湿后，颜色变亮，呈半透明状，很容易观察二者的区别。 
加Magi™ Coating Buffer时，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不要刺到PVDF膜。 
若加入的Magi™ Coating Buffer挂在孔壁上，盖上板盖，轻轻叩击，让Magi™ Coating Buffer顺势滑落。Magi™ Coating Buffer一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。 
3. 包被：润湿之后，无须洗涤。每孔加入50μL PBS稀释好的包被抗体，4°C包被过夜。 
4. 封闭：（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入用1×PBS稀释好的封闭液，37°C封闭1h。 
5. 倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。

第二天：接种细胞,加入刺激物，培养（严格注意无菌操作） 
整个实验设置1组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或实验动物）要设1组负对照（不加刺激物），整块板还要加1组背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有检测试剂）。 
1. 填好实验卡片，用以指导实验安排及细胞和试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设复孔（建议2-4孔，客户可根据实验要求自行调整复孔数目）。 
2. 取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，先加入200μL的Lympho-Spot™无血清培养基室温静置10min，然后倾倒。 
3. 细胞上板：按照实验卡片的安排，接种不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。 
（1）正对照：细胞浓度为1×104 cells/well。 
（2）细胞样品：样品细胞浓度请实验者自行摸索调整，通常为1～5×105cells/well。 
（3）背景负对照：加入100μL的Lympho-Spot™无血清培养基，该孔即为背景负对照孔。 
4. 刺激物：特异性刺激物和非特异性刺激物之分。 
5. 正对照孔加入10μL PHA，终浓度1-4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。 
6. 加入实验者自己的刺激物（用Lympho-Spot™无血清培养基配制成10×终浓度，10μL/well）到实验孔。加完刺激物后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀。实际上，通过扩散，刺激物会很快混合均匀。拍击板子会让细胞聚集分布在孔的外周。 
7. 加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24h。

注意： 
碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。 

第三天：培养后操作（不再需要无菌操作） 
1. 裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，200μL/孔加入冰冷的去离子水，4°C冰浴10min（低渗法裂解细胞）。 
2. 洗涤：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。 
3. 加入检测抗体：每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，37°C孵育1h。 
4. 洗涤：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。

注意： 
有实验者认为，洗涤检测抗体和酶标亲和素时，膜的背面也需要清洗。经我们验证，不清洗膜的背面也完全可以得到满意的结果，但是如果清洗，背景会更干净一些。所以，清洗膜的背面为实验的优化步骤，是否略过，由实验者自行决定。 
洗涤膜的背面，我们的方法是：在洗涤最后一次时，将去除塑料保护层的PVDF膜板底面浸入盛有干净PBST的浅托盘中，轻轻漂洗几次即可。 
一定要将膜背面和塑料保护层上的液体甩干后，再合拢，盖上，不要划伤到膜。 
5. 加入酶标亲和素：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37°C 1小时。 
6. 洗涤：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。 
7. 显色：解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置15-45min（在20 -25°C，显色25min较合适），注意避光。 
8. 待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。 
9. 将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

 

IHC实验步骤：

标本：组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片

操作步骤：

①石蜡切片制作

1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h

2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h

3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min

4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织

5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带

6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上

    （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）

7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h

②SP三步法

1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min

2、水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min

3、PBS冲洗2-3次，每次5min

4、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性

5、PBS冲洗2-3次，每次5min

6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温

7、PBS冲洗2-3次，每次5min

8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体

9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）

10、PBS冲洗2-3次，每次5min

11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h

12、PBS冲洗2-3次，每次5min

13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h

14、PBS冲洗2-3次，每次5min

15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）

（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）

（A：DAB  B：H2O2  C：磷酸缓冲液）

16、自来水冲洗10分钟终止反应

17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化

18、自来水冲洗10-15min

19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检

③结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。

WB实验步骤：

1、蛋白样品的制备：通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

2、做胶：检测抗原10－30kd, 用15％分离胶；30－100kd, 用10％分离胶；100－200kd，用7.5％分离胶。

3、跑胶：压缩胶电压：80V（10mA）；分离胶电压：120V（20mA）当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。

4、转膜：目的蛋白分子80-140kDa时，胶浓度8%，转移时间为1.5-2小时；目的蛋白分子25-80kDa时，胶浓度10%，转移时间为1.5小时；目的蛋白分子15-40kDa时，胶浓度12%，转移时间为0.75小时；目的蛋白分子＜20kDa时，胶浓度15%，转移时间为0.5小时；

5、封闭：脱脂奶粉（5％）、BSA、Western Blot 膜封闭液

6、一抗杂交：5％奶粉或2％BSA稀释抗体（称一抗），稀释比例按抗体说明,室温孵育1hr，TBST 洗5 mins 3-5 次。

7、二抗杂交：将膜跟5％奶粉或2％BSA稀释的2 抗一起孵育，室温1hr。TBST 洗5 mins 3-5 次。

8、底物显色：

 

流式实验步骤：

一、流式胞内细胞因子染色步骤

固定：

1. 在进行胞内染色之前（如：IFN-r或者IL-4），可根据BioLegend 细胞表面荧光染色步骤染表面标记，然后用Fixation Buffer (Cat：420801)固定细胞，每管0.5m l固定液，室温避光孵育固定20min。

2. 350g，离心，5 minutes，弃上清。

3. 如果有中止实验的需要，可在此步暂停，保存细胞一段时间，以备将来继续操作实验。用Cell Staining Buffer洗一遍细胞，350g，离心，5 minutes，弃上清。Cell Staining Buffer重悬细胞，可在4°C短期保存。或者用90% FCS/10% DMSO 在-80度较长期保存（注：针对固定后且无表面染色标记的细胞长期保存）。活化的人PBMC 的细胞因子的表达量会因供者的不同有所变化。因此 如果想纵向比较，冻存过的细胞来源于同一个供者较好。    

破膜：

4. 稀释10X的Permeabilization Wash Buffer (Cat. No. 421002)成1X的工作液

5. 用Permeabilization Wash Buffer重悬固定的细胞，350 g 离心 5-10 minutes，弃上清。

6. 2次重复步骤5。

胞内染色：

7. 100ul Permeabilization Wash Buffer 重悬固定破膜后的细胞，加入特定的荧光标记抗体（抗体量根据说明书加），室温避光20min。

8. 用 2 ml Permeabilization Wash Buffer 把细胞洗两遍。350 g离心 5 minutes，弃上清。

9. 如果一抗是生物素标记的，接下来就要加链霉亲和素偶联的二抗。再用Permeabilization Wash Buffer 洗2遍，350 g离心 5 minutes。

10. 用0.5 ml Cell Staining Buffer 重悬固定染色后的细胞，上机检测分析。

全血标本活化和胞内染色步骤：

1. 用无菌的组织培养液 1:1 稀释肝素抗凝的全血。

2. 可用抗原或者丝裂原体外刺激细胞。如果打算做胞内抗原如IFN-γ 或IL-4 ，添加蛋白转运抑制剂很关键，如brefeldin A (Cat. No.420601) 或者 monensin (Cat. No. 420701)。在添加适量的胞内刺激剂后，把全血分装到12 x75 mm的塑料培养管中，每管200ul，5% CO2 ，37°C，孵箱孵育4-6小时。

3. 加入2ml红细胞裂解液(Cat： 420301)，室温孵育5-10min。

4. 350 g 离心 5 minutes，弃上清。

5. 用Cell Staining Buffer再把细胞洗一遍，然后进行表面荧光染色。

6. 固定细胞，破膜，根据上面所描述的进行胞内抗原染色。

二、细胞表面抗原流式染色步骤

组织或细胞收集：

1．获取实验的组织（脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓），然后制备单细胞溶液，buffer用的是细胞染色液cell staining buffer（BioLegend Cat#420201）。如果是体外刺激培养的细胞，可简单的用cell staining buffer重悬已刺激的细胞，再进行步骤2。

2．添加细胞染色液到分离管至15ml，然后350g离心，5 min，弃上清。

红细胞裂解：

3．如果做的组织是脾脏，需要裂解红细胞。首先把10X的红细胞裂解液10X Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer (BioLegend Cat#420301)用去离子水配制成1X工作液。向管中加入3ml红细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育5min。

4．向管中加入10ml 细胞染色液以终止裂解作用。然后350g离心，5 min，弃上清。

5．重复步骤2洗细胞一遍。

6．活细胞计数后，加细胞染色液调整细胞数浓度在5-10 x 10^6cells/ml，以每管100ul的细胞液分装到流式管中，这样细胞数浓度接近于5-10 x 10^5cells/ml

FC受体阻断：

7．FC受体的阻断试剂可以有效的减少非特性的荧光染色。对小鼠标本，用anti-mouse CD16/CD32纯化抗体(针对Fcγ R III/II，BioLegend cat#101302, clone 93)，能阻断非特异的受体。加入5-10ug/ml的 anti-mouse CD16/CD32，冰上预孵育细胞10min，就可以了。由于没有用于人和大鼠的阻断FC的抗体，一个可选的方案就是用过量的不相关的纯Ig预孵育阻断。

细胞表面染色抗体：

8．加入适量的有荧光标记的、生物素化或者纯化的一抗（如： anti-CD3-FITC、anti-CD4-Biotin、anti-CD8-APC)到已准备好的细胞悬液里。 冰上暗处孵育15-20min。

9．加入至少2ml的细胞染色液洗2次，350g离心，5 min，弃上清。

10．如果先前加入的是纯化的一抗，则用管中残留的buffer 重悬细胞，再加入针对特定免疫球蛋白的荧光标记的二抗。二抗需是预先滴定到最佳浓度，且是抗一抗抗体种属来源并联有荧光的免疫球蛋白。例如：FITC-anti-mouse Ig。加入后冰上避光孵育15-20min。

如果先前加入的是生物素标记的一抗，则用管中残留的buffer 重悬细胞，再加入荧光SAv试剂。需是预先滴定到最佳浓度，连接有荧光素的SAv试剂。比如：SAv-PE.（BioLegend Cat# 405204）。加入后冰上避光孵育15-20min。

11．重复步骤 9.

12．加入0.5ml的Cell Staining Buffer重悬细胞，再加入5ul（含0.25ug/ million cells）的7-AAD活性染色剂(BioLegend cat#420403) 来排除死细胞。注意：BioLegend不建议使用7-AAD时合用PE/Cy5、 PerCP、或 PerCP/Cy5.5等染料。

13．冰上暗处孵育3-5min。

14．流式细胞仪分析。

全血标本的流式染色方案：

1．每管准备100ul 抗凝全，再加入预先滴定到最佳浓度的链有荧光素、生物素或者是纯化的一抗。

2．室温避光孵育15-20min。

3．把10X的红细胞裂解液(BioLegend Cat #420301)用去离子水配制成1X工作液，使用前室温平衡。每管（100ul全血，已孵育抗体）加2ml 的1X的红细胞裂解液，混匀，室温避光孵育10min。

4．350g离心，5 min，弃上清。

5．用至少2ml的Cell Staining Buffer洗一遍，350g离心，5 min，弃上清。

6，如果先前加入的是纯化的一抗，则用管中残留的buffer 重悬细胞，再加入针对特定免疫球蛋白的荧光标记的二抗。二抗需是预先滴定到最佳浓度，抗一抗种属并联有荧光的免疫球蛋白。比如说：FITC-anti-mouse Ig，加入后冰上避光孵育15-20min。

如果先前加入的是连有生物素的一抗，则用管中残留的buffer重悬细胞，再加入荧光SAv试剂。需是预先滴定到最佳浓度，连接有荧光素的SAv试剂。比如：SAv-PE.。加入后冰上避光孵育15-20min。

7．重复步骤5。

8．加入0.5ml的Cell Staining Buffer重悬细胞或者0.5ml含2%多聚甲醛的PBS固定液。

9．上流式分析。